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細(xì)胞株的篩選需要注意哪些因素

更新時(shí)間:2020-02-25      點(diǎn)擊次數(shù):2465
   細(xì)胞株在生物制藥中使用非常廣泛,細(xì)胞株培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單,貼壁強(qiáng)度適中,比較容易轉(zhuǎn)染,很適合用它來(lái)研究一般哺乳動(dòng)物基因的功能。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的污染不僅僅指微生物,而且還包括所有混入培養(yǎng)環(huán)境中的、對(duì)細(xì)胞生存有害或造成細(xì)胞不純的物質(zhì),包括生物和化學(xué)物質(zhì)。
  細(xì)胞株的篩選我們要注意加藥時(shí)間以及維持濃度:
  1.由于基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)之后要一段時(shí)間才能表達(dá)出蛋白質(zhì)。所以細(xì)胞株篩選時(shí)不能太早;但是也不能太晚,因?yàn)檗D(zhuǎn)染了外源基因的細(xì)胞代謝負(fù)荷較大,增值較慢,時(shí)間長(zhǎng)了就會(huì)被沒(méi)有外源基因轉(zhuǎn)入的細(xì)胞所淹沒(méi),終導(dǎo)致篩選不出陽(yáng)性克隆,一般要在轉(zhuǎn)染24小時(shí)之后才開(kāi)始加篩選。隨著細(xì)胞的代謝,濃度和活性都會(huì)下降,所以每3-5天都要更換一次篩選液。
  2.加抗生素的時(shí)機(jī),主要是考慮插入到細(xì)胞基因組的抗性基因是否已經(jīng)得到表達(dá)。一般是轉(zhuǎn)染48小時(shí)后加入抗生素。挑出單克隆后就可以用維持濃度,一般是穩(wěn)定細(xì)胞株篩選濃度的1/2。
  關(guān)于維持濃度,有人說(shuō)細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)對(duì)抗生素的抗性,應(yīng)不斷提高其濃度。而且如果要挑選幾個(gè)陽(yáng)性克隆中較高表達(dá)的克隆的話,可以調(diào)整抗生素的濃度。當(dāng)然,抗性基因高表達(dá),目的基因不一定就跟著高表達(dá)。
  此外,也需穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建培養(yǎng)液:
  加藥篩選穩(wěn)定細(xì)胞株約6天左右,細(xì)胞會(huì)大量死亡,孔中只剩下的細(xì)胞*。這時(shí)會(huì)出現(xiàn):
  1.死亡的細(xì)胞會(huì)裂解釋放出有害物質(zhì),導(dǎo)致那些有表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞死亡,即非選擇性死亡,因此要及時(shí)換液。
  2.孔中細(xì)胞數(shù)目很少,細(xì)胞之間的信號(hào)會(huì)變得很弱,也會(huì)導(dǎo)致陽(yáng)性細(xì)胞的狀態(tài)不佳甚至死亡。這個(gè)時(shí)候需要一種特殊的培養(yǎng)液,再轉(zhuǎn)染后篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株過(guò)程中就可以應(yīng)用這種培養(yǎng)基。
  3.適當(dāng)增加血清濃度。
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